Anlage 5
(zu § 14)

Zu Absatz 1 Nr. 3:

Die üblichen mikrobiologischen Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Hemmstoffen, die das Ergebnis der nachfolgenden Keimzahlbestimmungen beeinflussen können, sind zu Grunde zu legen.

Zu Absatz 2 Nr. 3:

Bestimmung der wasserlöslichen Kohlenhydrate nach v. Fellenberg (1)

Reagentien: Etwa n-Phosphorsäurelösung, hergestellt durch Verdünnen von 30 Milliliter konzentrierter (etwa 84%iger) Säure zu einem Liter kalt gesättigte Bariumhydroxidlösung.

5 Gramm Substanz werden genau abgewogen, in einem 250 Milliliter Messkolben mit ca. 100 Milliliter Wasser von 50 Grad Celsius versetzt und während fünf Minuten in einem Wasserbad von 50 Grad Celsius gehalten. Man kühlt ab, setzt 5 Milliliter Phosphorsäure und einen Tropfen Phenolphthaleinlösung zu, schwenkt um, macht mit Bariumhydroxidlösung schwach alkalisch und bringt die Rotfärbung durch tropfenweisen Zusatz von Phosphorsäure eben wieder zum Verschwinden. Der Kolben wird bei Normaltemperatur zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und die Lösung filtriert. Von dem klaren Filtrat werden 50 Milliliter zur Ausfällung der Albumine unter Zusatz von etwas Kieselgur aufgekocht und filtriert. Das Filter wird gründlich nachgewaschen, das Filtrat samt Waschwasser in einer Platinschale eingedampft, zwei Stunden bei 103 bis 105 Grad Celsius getrocknet, gewogen, verascht und wieder gewogen. Durch Multiplikation der Gewichtsdifferenz mit 100 erhält man den Prozentgehalt der löslichen Kohlenhydrate. Der wegen des Volumens des Unlöslichen entstehende Fehler wird durch Subtraktion von 0,12% für die ersten 10% und von weiteren 0,07 % für jede weiteren 10 % lösliche Kohlenhydrate korrigiert.

Zu Absatz 2 Nr. 4 Buchstabe a:

Die Keimzahlbestimmung (2)erfolgt nach Herstellung einer geeigneten Verdünnung unter Verwendung steriler Verdünnungsmittel und nach 48stündiger aerober Bebrütung bei einer Temperatur von 30 Grad Celsius auf einem nach folgendem Rezept hergestellten Nährboden:

Fleischextrakt, Pepton und Kochsalz werden in 600 bis 700 Milliliter destilliertem Wasser unter Aufkochen während zwanzig Minuten gelöst. Dabei wird durch Zugabe von Natronlauge der pH-Wert zunächst auf 7,8 eingestellt, um eine gute Ausflockung zu erzielen. Die Lösung wird nach dem Abkühlen durch Watte filtriert.

Die zwölf Stunden in destilliertem Wasser - bei mindestens dreimaligem Wasserwechsel - eingeweichte Agarmenge wird der nach vorstehender Anweisung hergestellten Nährlösung hinzugefügt, im Dampftopf aufgelöst und auf 1.000 Milliliter mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach anschließender Filtration wird der Milchzucker hinzugegeben und der pH-Wert (7,4 +/- 0,1) kontrolliert. Alsdann erfolgt die Zugabe der filtrierten Chinablaulösung. Das fertige Substrat wird im Autoklaven sterilisiert (1,0 bar, dreißig Minuten). Die pH-Kontrolle soll elektrometrisch oder nach einem anderen gleichwertigen Verfahren erfolgen.

Zu Absatz 2 Nr. 4 Buchstabe b:

Nachweis der Coli- und coliformen Bakterien mittels der TTC-Bouillon nach Schönberg:

Zweieinhalb bis drei Stunden kochen, filtrieren und im Dampftopf sterilisieren. Zu je 100 Milliliter dieser natursauren Bouillon (pH = 6,2 bis 6,4) werden 11 Milliliter einer 2%igen TTC-Lösung (Triphenyl-Tetrazoliumchlorid) zugefügt. Diese TTC-Bouillon wird zu 5 Milliliter in Reagenzröhrchen abgefüllt und bis zur Verwendung kühl und dunkel aufbewahrt.

Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Menge des flüssigen oder aufgelösten Lebensmittels beimpft; die Bebrütung erfolgt für achtzehn Stunden bei 37 Grad Celsius. Die positive Reaktion ist durch kräftig rote bis braunrote Färbung gekennzeichnet.

Zu Absatz 2 Nr. 4 Buchstabe c:

Nach Herstellung geeigneter Verdünnungen mit sterilen Verdünnungsmitteln wird unter aerober Bebrütung bei 37 Grad Celsius mit Calcium - Kaseinat - Agar nach folgendem Herstellungsrezept gearbeitet:

3,5 Gramm Caseinum purum Hammarsten (Pulver) werden in 50 Milliliter destilliertem Wasser eingeweicht. Nach fünfzehn Minuten werden 100 Milliliter gesättigtes Kalkwasser (1 Teil Calciumhydroxid und 104 Teile destilliertes Wasser, nach Absättigung zwei Mal mit gleichem Filter filtrieren) hinzugefügt und bis zur Lösung des Kaseins durchgeschüttelt (Lösung 1).

Lösung 2 besteht aus 20 Milliliter Bouillon (auf 1.000 ml destilliertes Wasser 3 g Fleischextrakt, 5 g Pepton aus Fleisch tryptisch verdaut, 5 g Kochsalz), 10 Milliliter Chlorcalciumlösung (0,15%ig), 10 Milliliter Phosphatlösung (aus 1,05% Na₂HPO₄ x H₂O und 0,35% K₂HPO₄ bestehend), 460 Milliliter destilliertem Wasser und 4,5% Agar. Im Dampftopf lösen. Einstellen auf pH = 7,6. Lösung dann zehn Minuten autoklavieren. Die Lösung 1 kommt dreißig Minuten in den Dampftopf. Nach Abkühlung auf 50 Grad Celsius wird Lösung 1 mit der auf 50 Grad Celsius vorgewärmten Lösung 2, der auf 150 Milliliter je 30 Milliliter einer frisch angesetzten Kaseinpeptonlösung (tryptisch verdaut) vor dem Vermischen hinzugefügt worden sind, zu gleichen Teilen vermischt und in Platten ausgegossen.